Epstein-Barr-Virus-VCA-IgM

VERWENDUNGSZWECK
Bei dem Epstein-Barr-Virus (EBV)-VCA-IgM-ELISA handelt es sich um einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) zum Nachweis von IgM-Klasse-Antikörpern gegen das Hüll-Antigen von EBV in humanem Serum oder Plasma. Dieser Assay ist ausschließlich für den In vitro-Gebrauch bestimmt.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) gehört zur Familie der Herpesviridae und ist der Erreger der infektiösen Mononukleose (IM). In immunsupprimierten Patienten ist das Epstein-Barr-Virus darüber hinaus mit dem Burkitt-Lymphom, dem Nasopharynxkarzinom sowie mit lymphoproliferativen Erkrankungen assoziiert. Welt weit zeigt das Virus eine ausgedehnte Verbreitung, bei welcher 80-90% der Bevölkerung seropositiv sind.
Die Labordiagnose der IM erfolgt traditionell durch den Nachweis heterophiler Antikörper,die sich im Infektionsverlauf im Serum entwickeln und Pferde-Erythrozyten agglutinieren. Diese Antikörper sind in Patienten mit einer IM jedoch nicht immer vorhanden; dies gilt vor allem dann, wenn die Patienten jünger als 14 Jahre sind. Weiterhin können die Antikörper über einen Zeitraum von mehr als einem Jahr nach der Infektion persistieren. Die ausschließliche Bestimmung heterophiler Antikörper kann daher eine fehlerhafte Diagnose zur Folge haben. Aus diesem Grund ist der Nachweis von Antikörpern gegen die viralen Antigene wichtig, wobei der Nachweis von Antikörpern gegen das „Virale Capsid-Antigen“ (VCA) und das nukleäre Antigen (EBNA) von besonderem Nutzen ist.
Während des Verlaufs der IM treten die IgM- und IgG-Klasse-Antikörper gegen VCA früh auf, wohingegen die IgG-Klasse-Antikörper gegen EBNA in einer späteren Phase der Infektion gebildet werden. Das Vorhandensein von IgM gegen VCA bei Fehlen von IgG gegen EBNA zeigt daher das Vorliegen einer aktuellen Infektion an, während die Präsenz von IgG sowohl gegen VCA als auch EBNA Hinweis auf eine zurückliegende Infektion ist.

TESTPRINZIP
Das E-EVM-K04 EBV-VCA-IgM-Kit basiert auf der ELISA-Methode. Bei Durchführung des Assays werden die Kontrollen und die Proben in Mikrotitrationswells inkubiert, die mit aufgereinigtem und inaktiviertem Epstein-Barr-Virus-Antigen beschichtet sind. Nach Inkubation und Waschen werden die Wells mit einem Konjugat behandelt, bestehend aus anti-humanen, Peroxidase-markierten IgM-Antikörpern. Nach einem zweiten Inkubations- und Waschschritt werden die Wells mit dem Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) inkubiert. Nach Zugabe einer sauren Stopp-Lösung wird das Ausmaß des enzymatischen Umsatzes des Substrats durch eine Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Die gemessene Absorption ist direkt proportional zur vorliegenden Konzentration von anti-EBV-VCA-IgM-Antikörpern.

REAGENZIEN
Die Menge an Reagenz im vorliegenden EBV-VCA-IgM-ELISA-Kit ist ausreichend für 96 Wells. In jedem Kit sind die nachfolgend angegebenen Reagenzien enthalten:

ENTHALTENES MATERIAL	MENGE	KATALOG-NR.
EBV-Capsid–Antigen-beschichteter MikrotitrationsstreifenWaschkonzentratProben-VerdünnungslösungTMB-SubstratNegativ-KontrolleCut-Off-KontrollePositiv-KontrolleZweitantikörper-KonjugatStopp-LösungSorbent G	Eine PlatteEine FlascheEine FlascheEine FlascheEin VialEin VialEin VialEine FlascheEine FlascheEine Flasche	E-EVM-10E-WSL-30E-DLB-40E-TMB-08E-EVM -01E- EVM-02E-EVM-03E-EVM-20E-STP-09E-SOR-21

NICHT ENTHALTENES MATERIAL

• Mikrotitrationsplatten-Lesegerät für Absorptionsmessung bei 450 nm
• Deionisiertes/Destilliertes Wasser
• Präzisionspipette zum Pipettieren von 10 ml, 100 ml und 1 ml
• Halbautomatische Pipette zum Pipettieren von 100 ml
• Automatische Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten
• Saugfähige Unterlage zum Trocknen der Streifen

Antigen-beschichtete Mikrotitrationsstreifen:
Ein Streifenhalter mit 12×8 (96) Mikrotitrationswells , beschichtet mit EBV-Capsid-Antigen. Lagern Sie die Mikrotitrationsstreifen bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C. Entnehmen Sie den Einsatz und die benötigten Streifen aus der Folienumverpackung und geben Sie die nicht verwendeten Streifen zusammen mit dem Silica-Gel in die Tasche aus Polyäthylen. Pressen Sie die Luft aus der Tasche und versiegeln Sie diese, indem Sie den Verschluss fest andrücken. Nach Anbruch ist das Produkt bei 2-8°C 4 Wochen stabil.

Waschkonzentrat:
Eine Flasche mit 100 ml einer 10-fach konzentrierten, phosphatgepufferten Salinelösung mit 0.5% Brij (Gewichtsprozent, w/v). Verdünnen Sie das Waschkonzentrat vor dem Gebrauch mit deionisiertem/destilliertem Wasser. Lagern Sie das Waschkonzentrat bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Proben-Verdünnungslösung: 
Eine Flasche mit 100 ml einer Proteinlösung mit 0.09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Lagern Sie die Proben-Verdünnungslösung bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

EBV VCA  IgM-Kontrollen:
Drei Vials, Negativ, Cut-Off und Positiv, mit jeweils 2 ml humanem Serum in einem 0.01 M Phosphatpuffer mit 0.09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Lagern Sie die Kontrollen bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Zweitantikörper-Konjugat:
Eine Flasche mit 12 ml Peroxidase-markierter, anti-humaner, monoklonaler IgM-Antikörper in einer Phosphatpuffer-Lösung mit 0.02% Proclin. Lagern Sie das Zweitantikörper-Konjugat bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Sorbent G : 
Eine Flasche mit 7 ml anti-humaner IgG in einer Phosphatpuffer-Lösung mit 0.02% Proclin. Lagern Sie das Sorbent G bei 2-8°C.

TMB-Substrat:
Eine Flasche mit 12 ml von in Citratpuffer, pH 3.8, stabilisiertem Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid. Lagern Sie das TMB-Substrat bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Stopp-Lösung:
Eine Flasche mit 15 ml einer 0.3 M H2SO4-Lösung. Lagern Sie die Stopp-Lösung bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

VORSICHTSMASSNAHMEN
Für den In vitro-Gebrauch.
Es sollten die nachfolgend aufgeführten, allgemeinen GLP (Gute Laborpraxis, Good Laboratory Practice)-Regeln beachtet werden:
Während des Umgangs mit immundiagnostischem Material sind Essen, Trinken, Rauchen sowie die Verwendung von Kosmetika untersagt. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. Tragen Sie während des Umgangs mit immundiagnostischem Material einen Labormantel und Einweghandschuhe. Waschen Sie sich nach Beenden der Arbeit gründlich die Hände. Decken Sie die Arbeitsfläche mit saugfähigem Papier für den Einweg-Gebrauch ab. Entfernen Sie verschüttetes Material umgehend und dekontaminieren Sie die betroffenen Oberflächen. Vermeiden Sie Aerosolbildung. Sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung. Befolgen Sie bei Handhabung und Entsorgung aller Reagenzien und Materialien die entsprechenden gesetzlichen Vorgaben.
WARNUNG: POTENTIELLER BIOLOGISCHER RISIKOSTOFF
Dieses Kit kann einige Reagenzien enthalten, die unter Verwendung von Material humanen Ursprungs (z. B. Serum oder Plasma) hergestellt oder zusammen mit diesem verwendet werden. Das in diesem Kit enthaltene Material wurde unter Verwendung CE-empfohlener Methoden nicht-reaktiv auf HIV-1/2-Antikörper, HCV und HBsAg getestet. Keine aktuelle Testmethode bietet eine vollständige Sicherheit hinsichtlich der biologischen Unbedenklichkeit. Handhaben Sie alle Reagenzien und Patientenproben entsprechend der Biologischen Sicherheitsstufe 2, wie in dem Handbuch der Centers for Disease Control/National Institutes of Health, „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,“ 4^thEdition, April 1999, für alle potentiell infektiösen humanen Materialien empfohlen.
WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN:
Einige der Reagenzien in diesem Kit enthalten als Konservierungsmittel Natriumazid in Konzentrationen unterhalb des behördlichen Grenzwerts von <0.1%. Trotz starker Verdünnung wirkt konzentriertes Natriumazid reizend auf Haut und Schleimhäute. Bei Reaktion von Natriumazid mit Rohrleitungen aus Blei und Kupfer kann es insbesondere bei Akkumulation zur Entstehung explosiver Metallazide kommen. TMB und Schwefelsäure wirken in größeren Mengen ebenfalls reizend auf Haut und Schleimhäute. Diese Substanzen liegen in verdünnter Form vor; dennoch besteht weiterhin ein geringes Risiko. Sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung. Vermeiden Sie einen Kontakt mit der Haut, den Augen und der Kleidung. Spülen Sie bei einem Kontakt mit einem der genannten Reagenzien die betroffene Stelle gründlich mit Wasser und suchen Sie einen Arzt auf. Führen Sie alle ungefährlichen Reagenzien erst nach Verdünnen mit einer großen Menge Wasser dem Abwasser zu, um einer Akkumulation chemischer Risikostoffe im Rohrleitungssystem vorzubeugen.
Für weitere Informationen hinsichtlich der in dem Kit enthaltenen Gefahrstoffe siehe die auf Anfrage erhältlichen, komponentenspezifischen MSDS.

PROBENAHME UND HANDHABUNG
Es sollte Serum verwendet werden. Bei der Probenahme sollten die allgemeinen Vorsichtmaßnahmen zur Venenpunktion beachtet werden. Die Proben können bei 2-8°C 2 Tage gelagert werden. Lagern Sie die Proben über einen längeren Zeitraum bei -20°C. Verwenden Sie keine hämolytischen oder lipämischen Proben. Vermeiden Sie ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Proben.

ASSAY-VORBEREITUNG
Das vollständige Verständnis der vorliegenden Packungsbeilage ist Voraussetzung für eine erfolgreiche Verwendung des Produkts. Zuverlässige Ergebnisse werden ausschließlich bei Anwendung präziser Labormethoden sowie sorgfältiger Befolgung der in der Packungsbeilage enthaltenen Angaben erzielt. Erwärmen Sie alle Proben und die im Kit enthaltenen Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (~25°C). Mischen Sie die Reagenzien und Proben durch vorsichtiges Invertieren vor der Verwendung gründlich. Vermeiden Sie die gemeinsame Verwendung verschiedener Chargen der einzelnen Kit-Komponenten innerhalb eines Assays. Verwenden Sie die einzelnen Komponenten nicht nach Ablauf des auf dem Aufkleber angegebenen Verfallsdatums. Unvollständiges Waschen hat einen nachteiligen Einfluss auf das Resultat und die Genauigkeit des Assays. Zur Verminderung potentieller Abweichungen infolge unterschiedlicher Substrat-Inkubationszeiten sollten die Stopp-Lösung und die TMB-Chromogen-Lösung in gleicher Reihenfolge und Geschwindigkeit in die Wells pipettiert werden. Vermeiden Sie eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien, insbesondere des Konjugats, des Waschpuffers und der Verdünnungslösung. Vermeiden Sie eine Verunreinigung der TMB-Chromogen-Lösung durch das Konjugat. Verwenden Sie eine saubere Einweg-Pipettenspitze für jedes Reagenz. Verwenden Sie keine Pipetten mit Komponenten aus Metall. Die für Konjugat und TMB verwendeten Gefäße und Spitzen halbautomatischer Pipetten können unter der Voraussetzung wiederverwendet werden, dass sie gründlich mit deionisiertem Wasser gespült sowie vor und nach jedem Gebrauch getrocknet werden. Das zur Markierung verwendete Enzym wird durch Sauerstoff inaktiviert und ist hochempfindlich gegenüber mikrobieller Kontamination, Natriumazid, hypochloriger Säure und aromatischen Chlorhydrocarbonen. Aromatische Chlorhydrocarbone werden häufig in der Wasserversorgung von Laboren nachgewiesen. Verwenden Sie qualitativ hochwertiges Wasser. Vermeiden Sie während der Lagerung und Inkubation der Reagenzien eine Exposition gegenüber großer Hitze oder starkem Sonnenlicht.

VORBEREITUNG DER REAGENZIEN:

Waschlösung:
Verdünnen Sie das Waschkonzentrat vor dem Gebrauch 1:10 mit deionisiertem/destilliertem Wasser. Lösen Sie eventuell vorhandene Kristalle vor dem Verdünnen bei 37°C. Geben Sie 100 ml des Waschkonzentrats in ein sauberes Gefäß und verdünnen Sie es durch Zugabe von 900 ml deionisiertes/destilliertes Wasser. Mischen Sie die Lösung gründlich durch Invertieren des Behälters. Die Waschlösung ist bei Lagerung in einer fest verschlossenen Flasche bei Raumtemperatur 5 Tage und bei 2-8°C 2 Wochen stabil.

Mirkotitrationsstreifen:
Wählen Sie die für den Assay erforderliche Anzahl von beschichteten Streifen. Die restlichen, nicht verwendeten Wells sollten zusammen mit einem Trockenmittelbeutel in der wiederverschließbaren Hülle aufbewahrt werden. Zum Schutz vor Feuchtigkeit  muss die Hülle erneut versiegelt werden.

Assay-Durchführung:
Alle Proben und Reagenzien müssen vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (~25°C) erwärmt werden. Serum-Proben und Kontrollen sollten in zweifacher Ausfertigung analysiert werden.

1. Kennzeichnen Sie die verwendeten Mikrotitrationsstreifen.
2. Verdünnen Sie die Serum-Proben im Verhältnis 1:101. Pipettieren Sie hierzu 10 ml Serum in 1 ml Assay-Puffer.
3. Pipettieren Sie jeweils 100 ml der verdünnten Serum-Proben sowie der gebrauchsfertigen Kontrollen in die entsprechenden Wells. Lassen Sie ein Well für den Leerwert frei. In dieses Well wird während des Substrat-Inkubationsschritts 100 ml des TMB-Substrats pipettiert. Fügen Sie 30 µl Sorbent G nur in den Wells hinzu, die die verdünnten Proben enthalten.
4. Bedecken Sie die Wells mit Schutzfolie und inkubieren Sie 45 Minuten bei 37°C.
5. Saugen Sie die Flüssigkeit in den Wells ab und waschen Sie jedes Well vier (4) Mal 30 Sekunden mit Waschlösung. Waschen Sie die Mikrotitrationsplatten mit Hilfe eines Dispensers manuell oder verwenden Sie eine automatische Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten. Drehen Sie die Platte um und legen Sie sie auf eine saugfähige Unterlage. Trocknen Sie die Platte durch vorsichtiges Ausklopfen.
   HINWEIS: Die Verwendung einer automatischen Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten wird nachdrücklich empfohlen. Unvollständiges Waschen hat einen nachteiligen Effekt auf die Assay-Genauigkeit. Ist keine automatische Waschvorrichtung verfügbar, dann (a) saugen Sie die Flüssigkeit vollständig aus jedem Well ab, (b) dispensieren Sie 0.35 ml Waschlösung in jedes Well und (c) wiederholen Sie Schritte (a) und (b) vier Mal.
6. Fügen Sie 100 ml des enzmymarkierten Zweitantikörper-Konjugats zu jedem Well hinzu.
7. Bedecken Sie die Wells mit Schutzfolie und inkubieren Sie 45 Minuten bei 37°C.
8. Saugen Sie die Flüssigkeit ab und waschen Sie jedes Well vier Mal 30 Sekunden lang mit Waschlösung. Waschen Sie die Mikrotitrationsplatten mit Hilfe eines Dispensers manuell oder verwenden Sie eine automatische Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten. Drehen Sie die Platte um und legen Sie sie auf eine saugfähige Unterlage. Trocknen Sie die Platte durch vorsichtiges Ausklopfen.
9. Fügen Sie mit Hilfe eines Dispensers100 ml TMB-Chromogen-Lösung zu jedem Well hinzu.
10. Inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie eine Exposition gegenüber direktem Sonnenlicht.
11. Fügen Sie mit Hilfe eines Dispensers 100 ml Stopp-Lösung zu jedem Well hinzu.
12. Messen Sie die Absorption der Lösung in den Wells innerhalb von 30 Minuten. Verwenden Sie ein auf 450 nm eingestelltes Lesegerät für Mikrotitrationsplatten. Ist eine Wellenlängekorrektur verfügbar, stellen Sie das Gerät auf duale Wellenlängenmessung bei 450 nm mit Hintergrund-Wellenlängenkorrektur bei 600 oder 620 nm ein.

ERGEBNISSE
Berechnen Sie den Mittelwert der Absorption für jede Kontrolle und jede Probe.

Qualitative Ergebnisse:

• Ist die Absorption der Probe höher als die des Cut-Off, ist die Probe positiv für das spezifische IgG.
  Berechnen Sie den Quotienten aus dem Mittelwert der OD der Probe und dem entsprechenden Cut-Off-Wert. Die Probe gilt als:
  Positiv: bei einem Quotienten von > 1.1.
  Nicht eindeutig: bei +/- 10% des Cut-Off.
  Negativ: bei einem Quotienten von < 0.9.

Wiederholen Sie den Test, falls das Ergebnis nicht eindeutig ist. Ist das Ergebnis weiterhin nicht eindeutig, dann wiederholen Sie die Serum-Probenahme.

EINSCHRÄNKUNGEN DER TESTDURCHFÜHRUNG

• Eine während der späten Phase der Infektion entnommene Serum-Probe wird mit diesem Assay möglicherweise negativ getestet, da in dieser Phase ausschließlich IgG-Antikörper vorhanden sind.
• Das Testergebnis sollte zusammen mit aus der Auswertung anderer klinischer und diagnostischer Verfahren verfügbaren Informationen verwendet werden.
• Vermeiden Sie ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Reagenzien und Proben.
• Vermeiden Sie die Verwendung stark hämolytischer, ikterischer oder lipämischer Proben.
• Vermeiden Sie die Verwendung hitzeinaktivierter Seren.

QUALITÄTSKONTROLLE
Subtrahieren Sie den Leerwert von allen anderen Messwerten. Die OD-Werte der Cut-Off-Kontrolle müssen mindestens 0.2 betragen. Die OD der Positiv-Kontrolle muss mindestens das 1.5-fache des Werts der Cut-Off-Kontrolle betragen.

PERFORMANZ-MERKMALE

1. Sensitivität und Spezifität

112 humane Seren wurden mit dem vorliegenden EBV-VCA-IgM-ELISA sowie einem Referenz-ELISA untersucht. Von 112 Proben wurden mit dem E-EVM-K04-ELISA 12 Proben positiv auf IgM-Antikörper gegen EBV-VCA-IgM getestet. Unter Verwendung des Referenz-ELISA wurden 13 Proben positiv getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammenfassend dargestellt.

	Positiv	Negativ	FN (falsch negativ)	FP (falsch positiv)
E-EVM-K04	12	100	1	0
Referenz	13	99

2. Genauigkeit

2. Inter-Aassay Studie
Anz. von Wiederh. 10	Serum 1	Serum 2	Serum 3
Mittelwert	1.29	0.91	0.23
SD	0.121	0.089	0.025
CV%	9.37	9.78	10.86

2. Intra-Aassay Studie
Anz. von Wiederh. 16	Serum 1	Serum 2	Serum 3
Mittelwert	1.43	0.98	0.26
SD	0.096	0.067	0.019
CV%	6.71	6.83	7.30

LITERATUR

• 1. A. Andersson, V. Vetter et al. Avidities of IgG directed against viral capsid antigen or early antigen: useful markers for significant Epstein-Barr Virus serology. J. Med. Virology 43: 238 (1994).
• J. Middeldorp and P. Herbrink: Epstein Barr Virus specific marker molecules for early diagnosis of infectious mononucleosis. J. Virol. Methods 21: 133 (1988).
• C. Valent Sumaya: Serological testing for Epstein Barr Virus – developments in interpretation. J. Inf. Dis. 151: 984 (1985).
• J. Luka, R.C. Chase and G. Pearson: A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against the major EBV-associated antigens. I. Correlation between ELISA and immunofluorescence titers using purified antigens. J. Immunol. Methods 67: 145 (1984).